アミノ酸メタボロミクスのための酵素チップの開発と診断・予防への応用

研究代表	富山県立大学工学部生物工学科 准教授 米田英伸
U R L	http://www.pu-toyama.ac.jp/BR/asano/
参画機関	富山県立大学、富山大学、石川県立大学、鳥取大学、岩手大学、味の素株式会社、株式会社インテックシステム研究所、株式会社リッチェル、株式会社TOPUバイオ研究所

　 　近年、メタボロミクスの隆盛により、血液中アミノ酸のバイオマーカーとしての利用が注目されている。我々は、血液中アミノ酸による疾病検出をより安価かつ簡易的に行うため、酵素を用いた定量法の開発を進めている。まず、新規なアミノ酸代謝酵素のスクリーニングや、タンパク質工学による改変により、特定のアミノ酸を特異的に定量できる酵素を開発し、これらの酵素を用いたアミノ酸定量法の開発を行った。具体的には、酸化酵素、脱水素酵素を中心とした高基質選択性アミノ酸定量用酵素の開発、同一原理によるタンパク質構成アミノ酸20種の定量法の開発、酵素チップによる電極型酵素センサーの開発、アミノ酸定量用酵素を用いた自動分析検査機器測定法の開発を行った。

１．酵素法によるアミノ酸定量法の開発（図１）

　新規なアミノ酸定量用酵素として、主にオキシダーゼやデヒドロゲナーゼを取得し、それらの酵素を用いた血液中等のアミノ酸の定量法を開発した。

リジン定量：Ｌ-リジンεオキシダーゼやＬ-リジンαオキシダーゼを使用することにより、従来のＬ-リジンの酵素定量法に比べ、特異性の高い酵素定量法を開発した。

スレオニン定量：細菌由来の新規なＬ-スレオニン3-デヒドロゲナーゼを取得し、特異性の高いＬ-スレオニン定量の開発に成功するとともに、全自動分析装置を用いた血漿中Ｌ-スレオニン定量への応用を検討した。　

グリシン定量：各種細菌より定量に適したグリシンオキシダーゼを選抜し、酵素的定量法の開発に成功するとともに、全自動分析装置を用いた血漿中グリシン定量への応用を検討した。

タウリン定量：タウリンジオキシゲナーゼと亜硫酸検出試薬であるイールマン試薬を用いることにより、正確かつ簡便な定量法に成功した。

この他、トリプトファン、メチオニン、シトルリン、アルギニンについても、特異的酵素の取得とアミノ酸定量法の開発に成功した。

図１　アミノ酸定量用酵素を用いた血漿中アミノ酸の高感度定量法の開発と自動分析検査機器測定法への応用

２．２０種類のタンパク質構成アミノ酸の同一原理による定量法の開発（図 2 ）

アミノ酸要求性の乳酸菌を用いることで、 2 種類の新規定量法の開発に成功した。まず、乳酸菌を測定試料中で培養し、そのATP生成をルシフェラーゼの発光により検出することで、迅速・高感度なアミノ酸定量を実現した。さらに、ルシフェラーゼを発現する組換え乳酸菌を構築・使用することで、より簡便・迅速なアミノ酸定量法を開発した。

図２　乳酸菌を用いたバイオアッセイによるアミノ酸定量

３．酵素センサーの開発

ディスポーザブル小型電極チップにフェニルアラニンデヒドロゲナーゼとジアホラーゼを固定化した酵素センサーを開発した。本酵素センサーは数μLの微量サンプルでも簡便に測定することができ、実用化に向けた研究を進めている。